羥脯氨酸檢測試劑盒（分光光度法）說明書

產品簡介：
HYP 是機體膠原蛋白主要成分之一，膠原蛋白大多分布于皮膚、腱、軟骨和血管等，因此HYP 含量是反映膠原組織代謝及纖維化程度的一項重要指標。樣品經水解產生游離的HYP，進一補被氯胺T 氧化，氧化產物與對二甲氨基苯甲醛反應，產生紅色化合物，在560nm 處有特征吸收峰。通過測定樣品水解液560nm 吸光值，可計算HYP 含量。

產品內容：
組織提取液：6mol/L 鹽酸，自備。濃鹽酸：H2O（V/V）= 1:1，室溫保存；
細胞提取液：液體100mL×1 瓶，4 ℃保存；
試劑一：液體10mL×1 瓶，4 ℃避光保存；
試劑二：液體10mL×1 瓶，4 ℃避光保存。

操作步驟：
一、羥脯氨酸提取：
1. 組織：取約0.5g 樣品于玻璃管，加入5mL 的組提取液，置于110℃烘箱，水解6 至12 小時16000rpm，25℃，離心20min，用提取液定容至5mL，取上清待測。
2. 細胞：取約500 萬個細胞，加入2mL 的細胞提取液，于高壓消毒器中15 磅保持30min，自然降壓后待測。
二、測定操作：
對照管測定管
樣本（mL） 0.2
試劑一（mL） 0.2 0.2
混勻，室溫靜置20min
試劑二（mL） 0.2 0.2
H2O（mL） 0.6 0.4
混勻，60℃，20min，取出后室溫靜置15 min，測定A560。(A560=A 測定-A 對照)

羥脯氨酸含量計算：
標準曲線：y=64.875x+ 0.0251，R2=0.9991
（1）按組織計算
HYP 含量（mg/g） =（A560-0.0251）÷64.875×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)
=0.385×（A560-0.0251）÷W
（3）按細胞計算：
HYP 含量（mg/104cell)= （A560-0.0251）÷64.875×V 反總÷V 樣×V 樣總÷細胞數量（萬個）
=0.154×（A560-0.0251）÷細胞數量（萬個）
V 反總：反應體系總體積，1mL； V 樣：反應中樣本體積，0.2mL；V 樣總：加入提取液體積，mL； W：
樣本質量，g。

注意事項：
1、OD 值大于0.8，樣品適當稀釋再測定，注意計算公式里乘以稀釋倍數。
2、試劑有一定的毒性，請操作時做好防護措施，防止吸入或與皮膚接觸。